Testy farmakologiczne służące do oceny autonomicznego odnerwienia źrenicy są powszechnie wykorzystywane w krajach Europy Zachodniej oraz Stanach Zjednoczonych. Główną ich zaletą jest możliwość zlokalizowania poziomu uszkodzenia dróg autonomicznych unerwiających źrenicę. Testy te stwarzają szansę na ograniczenie liczby innych kosztownych badań diagnostycznych, w tym obrazowych. Postępowanie takie ma szczególnie duże znaczenie w diagnostyce współczulnego odnerwienia źrenicy, ze względu na długość i skomplikowany przebieg drogi współczulnej. Substancje niezbędne do wykonywania testów farmakologicznych źrenicy nie są zarejestrowane w Polsce, co praktycznie wyklucza tę formę diagnostyki – ze względu na brak na rynku farmaceutycznym niezbędnych preparatów. Najbardziej użytecznymi testami w diagnostyce współczulnego odnerwienia źrenicy są testy z hydroksyamfetaminą oraz kokainą. Zastosowanie hydroksyamfetaminy pozwala odróżnić uszkodzenie pierwszego lub drugiego neuronu drogi współczulnej od uszkodzenia neuronu trzeciego, natomiast zastosowanie testu z kokainą umożliwia odróżnienie uszkodzenia pierwszego neuronu od uszkodzenia dwóch pozostałych neuronów. Tak więc wykonanie obydwu testów pozwoliłoby na precyzyjne rozróżnienie miejsca uszkodzenia drogi współczulnej unerwienia źrenicy. Niestety, preparat kokainy nie jest dostępny w Europie (stosuje się go jedynie w USA). W przypadku podejrzenia uszkodzenia drogi przywspółczulnej najważniejszą substancją używaną w testach jest karbachol, który jednak nie może być uznany za substancję idealną – po jego zastosowaniu (zakropleniu do oka) źrenica z uszkodzonym drugim neuronem i źrenica u pacjenta z zespołem Holmesa-Adiego zachowują się tak samo. Możliwe jest zatem tylko odróżnienie uszkodzenia pierwszego neuronu drogi przywspółczulnej od uszkodzenia neuronu drugiego lub od zespołu Holmesa-Adiego. Wykonując test z użyciem pilokarpiny, możemy wskazać jedynie farmakologiczne wyblokowanie receptorów cholinergicznych w szczelinie synaptycznej, wykluczając pozostałe przyczyny patologicznego rozszerzenia źrenicy, czyli uszkodzenie drogi przywspółczulnej.